Главная > Разное > Фотобиология
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

Глава XXV. ОБЩНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

В этой главе мы постараемся привести факты в подтверждение высказанного крупнейшим советским учёным, одним из основоположников современной молекулярной биологии В. А. Энгельгардтом положения: «общности среди многообразия, а также элементов родства у явлений и закономерностей, относящихся, казалось бы, к весьма отдаленным друг от друга сферам». Традиционной иллюстрацией положения В. А, Энгельгардта является, например, молекулярная биология гена. Код, с помощью которого записывается и расшифровывается наследственная информация у вирусов, микроорганизмов, растений и животных, в принципе, один и тот же: одни и те же триплеты ДНК кодируют одинаковые аминокислоты.

Задача этой главы — проследить черты общности и специфичности разнообразных фотобиологических процессов, рассмотренных в предыдущих главах.

Разумеется, свет не несет наследственную информацию, лежащую в основе индивидуального и эволюционного развития. Тем не менее он является важнейшим фактором внешней среды, с которым так или иначе взаимодействуют все формы живой материи. И самое главное — свет практически единственный внешний источник энергии для всей биосферы. Вторая важнейшая функция света — информационная. Со светом связано большое количество и других разнообразных биологических эффектов. Отсюда вытекают два важнейших вывода:

1) для фотобиологии в целом должно быть характерно большее многообразие, чем для «одноплановых», структурно-функциональных реакций (например, генетических), имеющих только одну биологическую задачу;

2) большего единообразия следует ожидать внутри однотипных фотобиологических реакций (например, фотосинтез).

К этим двум выводам можно добавить еще один. Поскольку все фотобиологические реакции начинаются со взаимодействия кванта света с веществом, приводящего к возникновению электронно-возбужденных состояний, наиболее выраженная общность всех реакций проявляется на их первых этапах. На последующих стадиях происходит специфическое разветвление процессов, приводящее к множественности путей реализации.

Итак, отправной точкой всей фотобиологии является свет, поглощенный молекулами биосубстрата и переведший их в электронно-возбужденное состояние. Электронно-возбужденные состояния возникают либо в результате поглощения кванта света самой молекулой (прямое возбуждение), либо вследствие миграции энергии от соседних молекул (косвенное возбуждение). Миграция энергии увеличивает поперечное сечение биологически активного поглощения (точнее, элементарного акта фотобиологической реакции), как это наблюдается, например, при фотосинтезе, где многие молекулы-светосборщики работают на одну молекулу реакционного центра. В других случаях миграция энергии выполняет защитную функцию. Например, перенос энергии от нуклеотидов ДНК к тирозину белков в хроматине снижает эффективность повреждающего действия УФ-света на геном, —

поперечное сечение биологически активного поглощения уменьшается.

Возникшие тем или иным способом возбужденные молекулы реализуют свою активность фотохимическим путем с участием синглетных и триплетных состояний.

Не исключена возможность и иного, «теплового» пути (тепловая диссипация), при котором в большей или меньшей степени наблюдается избирательный микроразогрев материала вокруг хромофора, что может привести к разрыву водородных, гидрофобных и других слабых связей и, как следствие, к конформациоиным перестройкам макромолекулы или даже мембраны.

Однако, как правило, в основе фотобиологии лежат именно фотохимические реакции. Для их осуществления обычно достаточно одного кванта света (одноквантовый процесс). Первичные фотохимические реакции, требующие двух квантов и начинающиеся от второго триплетного возбужденного состояния по схеме

в фотобиологии носят эпизодический характер. Подчиненное значение в фотобиологии имеют также двухквантовые процессы типа

где второй квант поглощается не триплетным состоянием, а лабильным или стабильным фотопродуктом, как это имеет место в фотохимии липидов или на заключительных стадиях биосинтеза хлорофилла.

Первичные фотохимические реакции многообразны и охватывают почти все превращения, рассмотренные в гл. II. На стадии образования первичных фотопродуктов возникает одна из трех ситуаций: либо хромофор претерпевает чисто внутримолекулярные химические перестройки, а соседние молекулы остаются химически неизменными (например, цис-гранс-изомеризация -цис- и -цис-ретиналя в родопсине и бактериородопсине соответственно) либо после быстрых и обратимых превращений хромофор не изменяется, а химические перестройки испытывает другая близлежащая молекула (такая фотокаталитическая функция хромофора свойственна хлорофиллу при фотосинтезе и красителю при фотодинамическом эффекте); либо изменяются одновременно и хромофор

и соседняя (или соседние) молекула. Последней может быть биологическая молекула того же (димеры тимина, цитозина, урацила) или другого (димеры тимин-цитозина, цитозин-урацила) типа, а также неорганические молекулы: урацила, превращение в белках, протохлорофиллид - хлорофиллид при биосинтезе хлорофилла).

В результате первичной фотохимической реакции, как правило, образуется свободный радикал. Известно три основных вида лабильных свободнорадикальных продуктов: катион-радикал, анион-радикал и нейтральный радикал. Благодаря неспаренным электронам свободные радикалы обладают высокой реакционной способностью.

In vitro известны также цепные свободнорадикальные фотохимические реакции, имеющие квантовые выходы вплоть до однако in vivo такие реакции пока не обнаружены. Возможно, известное исключение из правила составляет перекисное окисление липидов, индуцируемое УФ-светом. Тем не менее ряд фотохимических реакций в клетке может идти с квантовым выходом, близким к единице (восстановление хлорофиллом переносчиков электронов, цис-транс-изомеризация ретиналя в сетчатке). Подобная ситуация характерна и для хромофоров, практически не обладающих способностью к флуоресценции. Поскольку квантовый выход фотохимической реакции определяется соотношением констант скоростей (вероятностей) фотохимического люминесцентного и термодиссипативного путей дезактивации электронно-возбужденного состояния в соответствии с соотношением

то при скорость фотохимической реакции должна значительно превышать скорость диссипации энергии в тепло. Например, времена превращения родопсина в прелюмиродопсин и разделения зарядов в реакционном центре фотосинтеза лежат в пикйсекундном интервале.

В биологическом эксперименте можно определять как квантовый выход образования первичного лабильного фотопродукта, так и квантовый выход образования всех промежуточных продуктов вплоть до стабильного. В

случае, если конечный биологический макроэффект подчиняется закону «все или ничего» (гибель клетки, мутация, зарождение импульса в фоторецепторной клетке), можно ввести понятие квантового выхода биологической реакции

Величина квантового выхода бактерицидного действия характеризуется весьма низкими значениями: Однако экспоненциальная зависимость Доли выживших клеток от дозы света указывает на то, что к гибели клетки приводит поглощение одного-единственного кванта света, т. е. ничтожной энергии (около 10-21 ккал) достаточно для того, чтобы убить целую клетку. Иными словами, всего одна молекула «критического» фотопродукта способна реализоваться в конечный макроэффект — гибель клетки. В этом случае квантовые выходы образования критического (но не общего) фотопродукта и макроэффекта должны быть одинаковыми.

С точки зрения термодинамики все фотохимические реакции подразделяются на две категории: 1) эндергонические реакции, продукты которых имеют большие запасы свободной энергии, чем исходное вещество; в них запасается часть энергии квантов света (парциальные фотохимические реакции и фотосинтез в целом, бактериородопсиновый синтез АТФ); 2) экзергонические реакции, в которых энергия света не запасается в продуктах реакции, а нужна для преодоления активационного барьера (большинство фотохимических реакций).

Следовательно, в первом случае квант света «ценен» для клетки как источник свободной энергии, которая надолго и прочно утилизируется в форме богатых энергией химических продуктов (АТФ, сахара и т. д.), во втором — энергия кванта света берется лишь на время, «взаймы», для преодоления активационного барьера, конструирования активированного комплекса, причем после завершения фотохимической реакции она вновь отдается окружающей среде в виде тепла.

Чрезвычайно важно, что во всех случаях энергия, необходимая для преодоления активационного барьера

при «изготовлении» активных молекул, берется в основном не в тепловой форме, а в виде энергии света. Именно поэтому фотохимические реакции, в которых, как и в темновых реакциях, происходит химическое изменение вещества, сопряженное с преодолением энергетических барьеров, имеют ничтожно малые значения энергии (энтальпии) активации. Их скорости практически не зависят от температуры и целиком определяются концентрацией возбужденных молекул.

Причинами невыполнения этого общего правила могут быть следующие: 1) зависимость вероятностей тепловой дезактивации, -интерконверсии и люминесценции от температуры. Поскольку указанные процессы обычно идут с преодолением неодинаковых по величине энергетических барьеров, квантовый выход фотохимической реакции, складывающийся из соотношения вероятностей конкурирующих между собой различных путей дезактивации одной и той же возбужденной молекулы, может зависеть от температуры; 2) стерический, ориентационный фактор, существенный для биомолекулярных реакций. Для того чтобы реакция произошла, возбужденная и невозбужденная молекулы должны быть в момент столкновения ориентированы соответствующим образом. Поэтому при температурах замерзания образцов, где трансляционное и релаксационное движение молекул ограничено, правильно ориентированные молекулы быстро расходуются и при дальнейшем облучении реакция практически не идет как это имеет место при димеризации оснований в замороженных образцах;

3) температурно-зависимые, кооперативные конформационные переходы биополимеров (денатурационные и функциональные), в ходе которых меняются ориентация центров, микроокружение фотохимически активных хромофоров и устойчивость макромолекулы к фотопродуктам. Например, конформеры одних и тех же белков могут различаться по квантовым выходам фотоинактивации почти в 2 раза.

Совершенно очевидно, что в сложной цепи фотобиологических реакций, включающих наряду с первичными фотохимическими стадиями большее или меньшее число темновых химических реакций, скорость суммарного процесса (грубо говоря, время между световым импульсом

и конечной биологической реализацией света) сильно зависит от температуры. Суммарный процесс будет иметь энергию активации самой медленной лимитирующей стадии в цепи консекутивных реакций. При неизбежных потерях первичных или промежуточных фотопродуктов от температуры будет зависеть и квантовый выход фотобиологической реакции в целом. Так, температура, воздействуя на скорость деления клеток и активность ферментов репарации ДНК, влияет и на эффективность бактерицидного или мутагенного действия света в результате изменения концентрации димеров тимина.

Другой пример. Температурный коэффициент скорости фотосинтеза на интенсивном свету равен 2,5, а на слабом первом случае скорость суммарного процесса лимитируется темновой (биохимической), во втором — фотохимической стадией, термически не активируемой.

Следует подчеркнуть, что вероятность вступления синглетной или триплетной возбужденной молекулы в определенную фотохимическую реакцию зависит не только от количества запасенной энергии в ней, достаточного или недостаточного для преодоления энергетического барьера, но и еще, по крайней мере, от двух факторов: характера распределения электронной плотности (прежде всего валентных электронов) и в меньшей степени от расположения ядер, с одной стороны, и времени жизни возбужденных состояний — с другой. Например, разрыв 5,6-двойной связи с образованием циклобутановых димеров по и -углеродным атомам определяется рассмотренными ранее специфическими особенностями электронного облака в этой области у первого триплетного состояния. Очевидно также, что при прочих равных условиях вероятность фотохимического превращения вещества тем выше, чем больше время жизни электронновозбужденного состояния. Из сказанного выше следует еще один важный вывод: первичной «мишенью» действия света являются не ядра или электроны внутренних орбит, а валентные электроны.

Таким образом, вероятность, а следовательно, квантовый выход фотохимического превращения молекул определяются тремя показателями: запасами энергии,

электронно-ядерной архитектурой и временем жизни возбужденных состояний. По всем показателям синглетные и триплетные состояния различаются.

Обратим внимание еще на одну характерную особенность фотохимических реакций. Обычно все метаболические превращения в клетках носят ферментативный характер. В противоположность этому первичные фотохимические реакции не катализируются какими-либо специализированными ферментами. (Это не ферментативные реакции.) Единственным известным исключением из правила является фотореактивирующий энзим. Он способен образовывать фермент-субстратный комплекс с ДНК в темноте и быть катализатором лишь при освещении (мономеризация димера тимина). Кроме того, фотореактивирующий энзим представляет собой единственный достоверный пример, когда в каталитическом акте участвуют электронно-возбужденные состояния.

Большинство биологических хромофоров, участвующих в фотохимических, превращениях, соединены ковалентными или нековалентными связями с белковым носителем, который оказывает определенное влияние на ход фотохимических превращений. Так, с одной стороны, протохлорофиллид легко превращается в хлорофиллид в связанном с белком состоянии (протохлорофиллид — голохром), будучи фотохимически менее активным в свободном виде. Сказанное справедливо и для фотопревращений билитриеновой группировки фитохрома. С другой стороны, фотохимические перестройки хромофора приводят к конформационным модификациям белка-носителя (опсина в родопсине, белка фитохрома).

Итак, кванты света участвуют в жизненных процессах, как правило, через стабильные фотопродукты: первичный лабильный продукт — стабильный фотопродукт — биологический эффект. Стабильный продукт активно включается в метаболические процессы одним из двух возможных путей: является непосредственным участником биохимических, метаболических реакций, например в качестве субстрата ферментативных реакций или интермедиата биосинтезов (образование хлорофил-лида; АТФ и НАДФНг при фотосинтезе; синтез витамина и т. д.); непосредственно не участвуя в биохимических реакциях, он меняет конформацию либо

биополимеров (их активный центр), либо даже самой мембраны, модифицируя тем самым ферментативную, матричную (или иную) активность биополимеров и барьеры проницаемости (фотолиз триптофанилов и -S-S-связей в белках, цис-транс-изомеризация ретиналя в сетчатке, димеризация и гидратация пиримидиновых оснований ДНК или РНК и т. д.).

Первый путь характерен для биосинтетических и энергетических, второй — для информационных и деструктивно-модифицирующих реакций. В конечном счете при любой фотобиологической реакции стабильный, продукт способен приводить к изменениям морфологии, физиологии и характера движения организмов только через посредство метаболических, биохимических сдвигов. Ведь даже мутационные изменения ДНК реализуются только через биосинтез белка и последующие метаболические сдвиги.

Специфический аппарат, выработанный в ходе эволюции и предназначенный для реализации действия фотопродуктов и стыковки их с основными процессами жизнедеятельности, обычно представлен в физиологических реакциях, а в повреждающих, деструктивных, отсутствует. Здесь сдвиги в метаболизме наступают вследствие прямого повреждения жизненно важных биологических структур (ДНК, РНК, белков, мембраны), которые уже не выполняют или выполняют неправильно свои обычные темновые функции. Более того, для самого уникального и ключевого биополимера (ДНК) природа позаботилась о создании «антиусилительного», «ослабительно-го» аппарата, включающего несколько реагирующих систем, которые активно устраняют фотохимические дефекты макромолекулы.

Во избежание недоразумений следует оговориться, что в ходе эволюционного развития репарационные механизмы возникли, скорее всего, как противоядие против порчи генетического аппарата не только ультрафиолетом, но и проникающей радиацией, химическими веществами и спонтанными ошибками в ходе редупликации генетического материала (радиационный, химический и спонтанный мутагенез). Вместе с тем некоторые из них (например, SOS-система), по-видимому, приводят к появлению ошибок в ходе устранения дефектов, а возникающие

при этом мутации способствуют выживанию популяции в экстремальных условиях.

Возвращаясь к физиологическим фотореакциям, отметим, что естественный отбор сконструировал и изготовил специализированные механизмы реализации действия света двух типов: с усилением и без него. Последний работает, например, в фотосинтезе (транспорт электронов с фотосинтетическим фосфорилированием), который с известными энергетическими потерями запасает в органических молекулах лишь часть энергии света (около 30-40%).

Усилительные механизмы в наиболее выраженной и совершенной форме представлены в информационных фотобиологических реакциях, в первую очередь в зрительных. Здесь достаточно попадания в зрительную клетку сетчатки глаза одного или нескольких квантов света, чтобы в нервном волокне возник спайк. Как и в самом совершенном радиоэлектронном устройстве, в этом случае коэффициент усиления по мощности достигает 105—106.

Завершающей стадией любой фотобиологической реакции является конечный макроэффект (синтез органического вещества, движение биообъекта, изменение наследственных свойств организма, гибель клетки и т. д.). Макроэффект может быть достигнут либо сразу после поглощения эффективной дозы света, либо спустя более или менее длительный промежуток времени (лаг-фаза). Продолжительность лаг-фазы определяется не столько фотофизическими и фотохимическими стадиями, сколько аппаратом реализации: его сложностью, числом стадий, оперативностью работы (кинетическими параметрами). Разумеется, что продолжительность лаг-фазы будет в сильной степени зависеть и от внешних условий (температура, состав окружающей среды и т. д.).

Таким образом, рассмотрены все основные стадии фотобиологических реакций: фотофизика, первичная фотохимия, лабильные и стабильные фотопродукты, механизмы реализации и конечный биологический эффект. На многочисленных примерах показано, что даже разнотипные реакции (энергетические, биосинтетические, информационные, деструктивно-модифицирующие) при всем их разнообразии внутренне едины. В еще большей

степени это справедливо для однотипных реакций, характеризующихся, как правило, идентичными хромофорами с близкой фотофизикой и фотохимией, а также сходными механизмами реализации. Эти моменты отмечены в соответствующих главах. Внутреннее единство самых разнообразных фотобиологических процессов становится еще более очевидным при рассмотрении роли мембран в фотобиологии.

Следует еще раз напомнить, что большинство хромофоров включено в состав мембран или ассоциировано с ними. Специфика микроокружения хромофора в мембране оказывает существенное влияние на ход фотофизических и фотохимических реакций. Так, включение хромофоров в состав мембран приводит к значительным изменениям параметров поглощения и люминесценции.

Серьезные конформационно-зависимые модификации претерпевают и фотохимические реакции. Например, квантовые выходы инактивации ацетилхолинэстеразы в свободном состоянии и в составе мембраны значительно различаются между собой. Мембрана тормозит фотоокисление липидов; изменение энтропии активации перехода люмиродопсин—инетародопсин I в мембранах палочек в 2 раза меньше, чем в дигитониновых экстрактах. Следовательно, мембрана может ускорять или замедлять фотохимические реакции и даже менять их направление в зависимости от биологической «целесообразности».

Кроме того, способность мембран существовать в нескольких дискретных конформационных состояниях с кооперативными переходами между ними открывает эффективный путь регуляции фотобиологических процессов. Свет также способен инициировать подобные переходы, причем конформационные перестройки могут выступать в роли механизма темнового усиления.

Наиболее правдоподобной представляется следующая картина. Квант света вызывает фотохимические изменения встроенной в мембрану молекулы, в результате чего ее стереометрия сильно нарушается: продукт уже не соответствует той структурной ячейке в мембране, которую занимала ранее исходная, немодифицированная, молекула. Образовавшееся «инородное» тело создает эффект локального «механического напряжения», вызывающего волну распространяющихся по мембране

структурных преобразований. Благодаря этому становится возможным выраженное дальнодействие: продукт контролирует структурное и функциональное состояние различных участков мембраны, пространственно удаленных от места протекания фотохимической реакции,— феномен фотохимической аллотопии.

В ходе эволюции природа предусмотрела своеобразные отношения между стабильным фотопродуктом и мембраной, которые можно было бы назвать принципом «антикомплементарности»: в процессе фотохимической реакции возникают нарушения геометрических параметров взаимодействия исходной молекулы и образовавшегося стабильного фотопродукта, ответственного за дальнейшие биологические последствия, с мембраной.

Отнюдь не случайно, что в основе наиболее совершенной, информационной фотобиологической реакции (зрение у животных) лежит фотохимическая реакция цис-транс-изомеризации. Для этой реакции характерны высокая эффективность и легкая обратимость. Более того, изомеризация хромофора благодаря значительным изменениям его стереометрии может быть причиной наиболее глубоких изменений в конформации носителя (белок, липопротеидный комплекс, мембрана), что является опорной точкой механизмов усиления.

Эта мысль подтверждается модельными опытами, выполненными за последние годы. Цис- и транс-формы красителя, комплексиру-ющегося с холинэстеразой и трипсином в растворе, обладают явно неодинаковой ингибирующей ферменты активностью. В итоге свет, индуцирующий обратимые цис-транс-переходы, регулирует уровень ферментативной активности белкового носителя. По данным И. В. Березина и др., чис-форма комплекса циннамоил-а-химотрипсина лишена ферментативной активности. При фото-тракс-изомеризации циннамоила происходит отрыв ингибитора и восстановление нормального уровня активности. Более того, аналогичная регуляция воспроизводится при комплексировании красителя с клеточной мембраной: цис-транс-переходы, очевидно, через обратимые конформационные перестройки мембраны изменяют ее проницаемость. Фотоиндуциро-ванные изменения проницаемости четко зарегистрированы на искусственных фосфолипидных мембранах после включения в них таких биологически активных хромофоров или их комплексов, как родопсин, фитохром и флавины.

Таким образом, внутренняя взаимосвязь между молекулярными и мембранными аспектами фотобиологических процессов достаточно отчетлива. Квант света

инициирует структурные перестройки мембран, а их исходное состояние сильно влияет на фотофизические, фотохимические и «реализационные» реакции.

С одной стороны, в мембране в строгом порядке размещены как хромофоры, так и молекулярные партнеры фотохимических превращений; с другой — в ней устанавливается специфика и уровень межмолекулярных взаимодействий. Наконец, мембрана выступает в роли своеобразной сетки в триоде, усиливающей через изменения барьера проницаемости небольшие фотохимические сигналы. Можно думать, что именно мембранный уровень определяет во многих случаях широкую вариабельность эффективности действия света на биологические объекты, зависящую от многих факторов внешней среды: температуры, солевого состава, питания и т. д. Становится все более очевидным также, что регуляция эффективности фотобиологических реакций осуществляется главным образом на мембранном уровне.

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление