Главная > Разное > Фотобиология
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

5. ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ СТАДИИ ФОТОСИНТЕЗА

Как и другие фотобиологические реакции, фотосинтез начинается с поглощения кванта света специализированными хромофорами, которые можно подразделить на три основные группы (табл. 3, 4): хлорофиллы, каротиноиды, фикобилины. Роль этих пигментов как акцепторов света доказывается многочисленными измерениями спектров действия фотосинтеза.

Наибольшее значение в фотосинтезе играют хлорофиллы, главным образом хлорофилл а.

Хлорофилл а состоит из «головки» (замкнутое через метанные мостики тетрапиррольное форбиновое кольцо) и «хвоста» (многоатомный спирт фитол). В центре молекулы находится магний, соединенный координационными связями с атомами азота каждого из четырех пиррольных колец. Все остальные хлорофиллы бактерио-хлорофиллы отличаются по структуре от хлорофилла а тремя признаками: 1) строением «хвоста» (у хлорофилла с он отсутствует); 2) заменой заместителей в форбиновом кольце (у хлорофилла во втором пир рольном кольце метильная группа замещается на альдегидную); 3) числом или распределением двойных связей

Таблица 3. (см. скан) Спектральные свойства хлорофиллов


в кольцевой системе. Для бактериохлорофилла характерно расположение гидрированных пиррольных колец, противоположное тому, которое свойственно хлорофиллу.

Все хлорофиллы интенсивно поглощают видимый свет. В спектрах поглощения хлорофиллов заметны четыре полосы: три в красно-желтой и одна в синей области. Наиболее интенсивная коротковолновая полоса называется полосой Соре. Она характерна для всех порфиринов, представляющих собой замкнутую тетрапиррольную систему с сопряженными двойными связями. Спектральные характеристики хлорофилловых пигментов представлены в табл. 3 и на рис. 10. В первом приближении максимумы в красно-желтой области спектра формируются сложной комбинацией двух электронно-колебательных

Таблица 4. (см. скан) Спектральные свойства важнейших каротиноидов (каротины, каротенолы) и фикобилинов


-переходов. Два электронных -перехода ответственны также за образование полосы Соре.

Все хлорофилловые пигменты обладают интенсивной флуоресценцией в малополярных растворителях: хлорофилл а в серном эфире имеет максимумы флуоресценции при Обе полосы флуоресценции хлорофилла

обусловлены одним и тем же электронным переходом, причем первому максимуму соответствует линейный, второму— плоский осциллятор, обладающий одинаковыми составляющими по двум взаимно перпендикулярным направлениям в плоскости молекулы.

Рис. 10. Спектры поглощения хлорофиллов в эфире (French С., 1962): удельный коэффициент абсорбции (С — концентрация,

В последние годы обнаружена низкотемпературная фосфоресценция хлорофиллов а и (моносольваты, дисольваты, мономерные и агрегированные формы) в различных растворителях. Фосфоресценция характеризуется максимумами в области и временами жизни

Кроме того, об активности триплетных состояний хлорофилловых пигментов свидетельствуют: 1) замедленная флуоресценция, связанная как с аннигиляцией триплетных молекул при соударениях, так и с внутримолекулярным термоиндуцированным триплет-синглетным переходом, 2) сенсибилизированная триплетным состоянием люминесценция возбужденного синглетного кислорода с максимумом свечения при 1270 нм.

Каротиноиды построены из линейно соединенных друг с другом изопреновых единиц

К концам полиизопреновой цепи у многих каротиноидов присоединены ароматические иононовые группировки. Как правило, молекула каротиноидов состоит из восьми изопреновых единиц и включает в себя 40 углеродных атомов.

Каротиноиды бывают ациклические, моноциклические (одно шестиуглеродное кольцо на конце линейной цепи) и бициклические (два шестиуглеродных кольца на каждом из концов линейной цепи). Различают -иононовые и -иононовые кольца. Каротиноиды подразделяются на каротины и каротинолы, или ксантофиллы (лю-теин, виолаксантин, фукоксантин, спириллоксантин). Основной каротиноид зеленых растений — -каротин. Положение длинноволновой полосы каротиноидов создает условия для поглощения фотосинтетиками синего света (400—500 нм).

Фикобилины, содержащиеся в сине-зеленых и красных водорослях, по строению отличаются от других пигментов фотосинтезирующих организмов. Известны три вида фикобилинов: фикоэритрин, фикоцианин и аллофикоцианин. В противоположность пигментам первых двух классов фикобилины представляют собой макромолекулы — хромопротеиды, состоящие из специфических белков и прочно связанных с ними ковалентными связями хромофорных групп. Молекулярный вес хромопротеидов порядка Белковый носитель состоит, по крайней мере, из шести субъединиц. Простетическая группа хромопротеида — незамкнутая тетрапиррольная цепь, аналог желчных кислот.

Наиболее вероятно, что в состав фикоэритрина входит мезобилиродин, а в состав фикоцианина — мезобиливиолин. Каждая макромолекула фикобилина содержит несколько одинаковых хромофорных группировок. Длинноволновые полосы поглощения фикобилинов расположены в желто-оранжевой области (рис. 11). Судя по поляризационным спектрам флуоресценции, три длинноволновые полосы поглощения фикобилинов относятся к одному электронному переходу.

Для фикобилиновых пигментов характерен большой коэффициент экстинкции (порядка 105) и высокий квантовый выход флуоресценции (около 0,9). Следует отметить, что хромофорные группировки, отделенные от

носителя, резко изменяют спектр поглощения и утрачивают способность к флуоресценции.

Спектры поглощения фотосинтетических пигментов в клетках зеленых растений сдвинуты в длинноволновую область по сравнению с таковыми для растворов в органических растворителях. Это указывает на интенсивный характер взаимодействия пигмент — микроокружение. По-видимому, особо важную роль играют пигмент-белковые, пигмент-липидные и пигмент-пигментные слабые физико-химические взаимодействия.

Рис. 11. Спектры поглощения фикоэритрииа фикоцианина (2) и аллофико-цианина (3) (Нахо F. et al., 1955)

В различных растительных и микробных организмах встречаются всевозможные комбинации пигментов. Однако во всех случаях обязательно присутствие хлорофилла а (или бактериохло-рофилла а), через который и реализуется первичное фотохимическое действие света.

Поэтому все пигменты фотосинтезирующих организмов разделяются на основные (хлорофилл а и бактериохлорофилл а) и дополнительные (каротиноиды, фикобилины и все остальные хлорофиллы). Большой арсенал дополнительных пигментов, перекрывающих своим поглощением практически весь «видимый» и часть ближнего инфракрасного спектра, позволяет фотосинтетикам активно улавливать падающую на Землю световую радиацию, которая исходит от ближайшего к ней галактического тела — Солнца.

В хлоропласте листа пигменты-светосборщики, активные формы хлорофилла а и ферменты, катализирующие темновые реакции, объединены в единую систему — фотосинтетическую единицу. В аналогичные единицы организован и фотосинтетический аппарат микроорганизмов. К мысли о существовании фотосинтетических единиц привели следующие неоднократно подтвержденные наблюдения.

1. Отсутствие латентного периода в появлении конечных

продуктов фотосинтеза. При освещении растения светом такой интенсивности, при которой интервал времени между последовательными актами поглощения одной определенной молекулой хлорофилла составляет 10 мин, следовало бы ожидать проявления не менее -минутного индукционного периода (поскольку для выделения одной молекулы кислорода нужно поглощение минимум четырех квантов света).

Рис. 12. Модель фото-синтетической единицы (Schmid G" Gaf-fron Н., 1971)

Однако в эксперименте кислород выделяется практически сразу после освещения листа кратковременной вспышкой света.

2. Эффект насыщения фотосинтеза. При увеличении интенсивности света скорость фотосинтеза возрастает только до определенного порога. Изменяя продолжительность темновых интервалов при использовании насыщающего импульсного освещения, можно определить длительность работы темнового аппарата. Тогда можно подобрать такую интенсивность и время насыщающей вспышки, при которых все молекулы хлорофилла, непосредственно связанные с темновым аппаратом, будут однократно загружены (не сработают дважды) и каждая из них будет инициировать образование одной молекулы промежуточного стабильного продукта. С учетом квантового расхода фотосинтеза по числу молекул конечного продукта (число выделенных молекул или поглощенных молекул можно рассчитать число фотохимически активных молекул хлорофилла, сопряженных с темновыми реакциями. Таким способом было рассчитано, что в фотосинтетическом аппарате на каждую активную молекулу хлорофилла приходится (по данным Эмерсона и Арнольда) 2400 молекул фотохимически неактивного хлорофилла. По более поздним данным Шмида и Гаффрона, количество неактивных молекул хлорофилла в фотосинтетической единице в зависимости от физиологического состояния и освещения равно 300, 600, 1200, 2400, 4800 (рис. 12).

Таким образом, фотосинтетическая единица представляет совой структурно-функциональное образование,

локализованное в мембранной системе хлоропластов, в котором большое число молекул-светосборщиков работает на фотохимически активный хлорофилл как энергетическую ловушку. Только хлорофилл запускает цепь темно-вых реакций, ведущих к образованию конечных продуктов фотосинтеза.

Передача энергии в системе пигменты-светосборщики — фотохимически активный хлорофилл осуществляется с помощью миграционных механизмов. Фотофизическая стадия фотосинтеза включает миграцию энергии как между однородными, так и между разнородными молекулами пигментов. Оценка ее эффективности произведена в 1952 г. Дюйсенсом, а также независимо от него Френчем и В дальнейшем удалось выявить миграцию энергии между следующими партнерами: каротиноиды—уфикоэритрин—уфикоцианин—хлорофилл, хлорофилл -ухлорофилл а, хлорофилл -хлорофилл а, каротиноиды-бактериохлорофилл а. В первой цепи возможна миграция от каждого из партнеров прямо к хлорофиллу а.

В настоящее время твердо установлена гетерогенность хлорофилла и бактериохлорофилла в клетке, т. е. спектральная дискретность химически тождественных молекул пигментов, обусловленная различиями в характере и интенсивности взаимодействия пигмент — микроокружение. Формы хлорофилла различаются по расположению электронно-колебательных уровней, а также по другим физико-химическим свойствам, таким, как извлекаемость органическими растворителями, устойчивость к действию света, ультразвука, феофитинизации.

По данным низкотемпературной и производной спектрофотометрии, в хлоропластах представлено восемь нативных форм хлорофилла а, каждая из которых характеризуется узкой полосой поглощения в красной области (661, 668, 675, 681, 686, 693, 700, 710 нм). Такая система форм универсальна для организмов различных филогенетических групп. По мнению Ф. Ф. Литвина, эти формы представляют собой термодинамически устойчивые типы агрегатов пигмента. Ему удалось проследить самосборку агрегатов с аналогичными спектральными свойствами в пленках, монослоях и растворах пигментов.

Миграция энергии между различными формами

хлорофилла и бактериохлорофилла наблюдается как in vivo, так и in vitro. Зарегистрированы, например, следующие донор-акцепторные пары: хлорофилл а 668 -> хлорофилл а 681; хлорофилл а 681 -> хлорофилл а 693; бакте-риохлорофилл 800-> бактериохлорофилл 890; бактерио-хлорофилл 800-> бактериохлорофилл 850; бактериохлорофилл 850 -> бактериохлорофилл 890. Эффективная миграция энергии между одними и теми же формами пигмента хлорофилла а наблюдается также в модельных системах, содержащих агрегаты пигментов нескольких типов.

Представление об эффективности миграции энергии дают следующие данные: квантовые выходы миграции энергии от каротиноидов к хлорофиллу а, от фикоэритрина к хлорофиллу а, от хлорофилла к хлорофиллу а, от одной формы хлорофилла а к другой составляют соответственно 20—50, 80—90, 100, 100%.

Приемы экспериментального доказательства миграции энергии между фотосинтетическими пигментами in vivo и in vitro целесообразно объединить в четыре группы.

1. Тушение собственной флуоресценции донора энергии и сенсибилизация флуоресценции акцептора. Например, хлорофилл флуоресцирует в растворе и в мутантах, в которых хлорофиллы а и пространственно разобщены, но не флуоресцирует в нормальной клетке, где поглощенная энергия передается хлорофиллу а (сенсибилизация). Наиболее корректным проявлением сенсибилизированной флуоресценции являются спектры действия флуоресценции акцептора, в которых обнаруживаются не только его собственные полосы поглощения, но и полосы доноров энергии. Например, в спектрах действия флуоресценции хлорофилла а зеленых растений представлена полоса поглощения хлорофилла а в бурых, красных, сине-зеленых водорослях — полосы поглощения фикоэри-трина (540—565 нм), фикоцианина (620—630 нм) и каротиноидов (480—500 нм). Сопоставление спектров поглощения донора и акцептора со спектрами возбуждения флуоресценции акцептора позволяет оценить квантовые выходы (эффективность) миграции энергии.

2. Проявление в спектрах действия самого фотосинтеза, оцениваемого по выделению кислорода, максимумов, принадлежащих акцессорным пигментам (рис. 13).

3. Увеличение времени жизни флуоресценции хлорофилла в клетках водорослей при переходе от прямого возбуждения в собственной полосе поглощения (680 нм) к монохроматическому возбуждению в полосах поглощения фикоэритрина и фикоцианина (время миграции + время флуоресценции).

Рис. 13. Спектр поглощения (1) и спектр действия (2) красной водоросли Porphyra nereocystis, а также спектр поглощения экстрагированного фикоэритрина (3) (Нахо F., Blinks L., 1950)

На основании полученных временных характеристик флуоресценции хлорофилла а при последовательности возбуждения хлорофилл а, хлорофилл фикоцианин были рассчитаны времена миграции энергии. Они оказались равными фикоцианин), с (фикоцианинхлорофилл а), с (хлорофилл хлорофилл а).

4. Уменьшение степени поляризации флуоресценции по мере зеленения этиолированных биологических объектов, свидетельствующее о миграции энергии между химически идентичными молекулами хлорофилла а.

Между следующими донор-акцепторными партнерами (фикоэритрин — фикоцианин — хлорофилл, хлорофилл хлорофилл а, одна форма хлорофилла а или бактериохлорофилла а — другая) миграция энергии осуществляется по индуктивно-резонансному механизму при соблюдении правил Ферстера, обязательных для переноса этого типа. В то же время перенос энергии каротиноид хлорофилл а происходит, по-видимому, не по индуктивно-резонансному механизму, поскольку донор энергии практически не флуоресцирует, а по типу экситона или комплекса с переносом заряда. Миграция энергии с каротина на хлорофилл -ная эффективность) воспроизводится в монослоях и пленках пигментов при достаточно тесном контакте молекул.

Теоретически вероятен и обменно-резонансный триплет-триплетный механизм миграции энергии между пигментами, поскольку пространственные требования (расстояние между молекулами порядка 10 А) для него в хлоропласте выполняются. Расчет показывает, что при концентрации хлорофилла в гране среднее расстояние между его молекулами составляет 10—20 А, а в ассоциатах пигмента in vitro еще меньше — 6—10 А. Однако в эксперименте (флеш-фотолиз) не удалось обнаружить заселенности триплетных уровней хлорофилла в растительных объектах не только при физиологических условиях, но и после почти полного (95%) окисления реакционных центров, являющихся «стоком» энергии возбуждения. Вполне понятно, что после перекрытия каналов к реакционным центрам, являющимся ловушками энергии, создаются благоприятные условия для спектрального выявления триплетных состояний пигмента.

В последние годы широко обсуждается вопрос об экситонном и полупроводниковом механизмах миграции энергии между молекулами хлорофилла а в пределах одной фотосинтетической единицы. Кроме теоретических предпосылок, стимулом к этому явилось обнаружение у изолированных пигментов фотопроводимости и полупроводниковой фототермолюминесценции, а также эффекта фотопроводимости у пленок сухих хлоропластов. Однако низкие значения квантового выхода фотопроводимости сухих хлоропластов ставят под сомнение биологическую значимость переноса энергии по полупроводниковому механизму. Хотя эта величина возрастает до после учета малого времени жизни носителей заряда, отсутствие фотопроводимости во влажных пленках хлоропластов оставляет вопрос о полупроводниковой миграции энергии in vivo открытым.

Таким образом, миграция энергии обеспечивает эффективный сбор квантов света и транспорт поглощенной энергии к молекулам хлорофилла, которые непосредственно связаны с аппаратом, осуществляющим темновые стадии фотосинтеза. Иными словами, обнаруживается четкое разделение функций между молекулами хлорофилла, причем наряду со сборщиками энергии — простыми физическими сенсибилизаторами — формируется

небольшая доля (около 1%) «избранных» молекул (реакционные центры). Испытывая обратимые фотохимические окислительно-восстановительные превращения, эти молекулы запускают цепь транспорта электронов, представляющую собой стартовый акт химизма фотосинтеза.

Независимо от физической предыстории возникновения электронно-возбужденных состояний «избранных» молекул их стыковка с окислительно-восстановительными реакциями может идти либо через нижний синглетный, либо через нижний триплетный возбужденный уровень.

Согласно теоретическим квантовомеханическим расчетам, для хлорофилла характерна обычная схема расположения электронно-колебательных синглетных и триплетных уровней. Действительно, в многочисленных экспериментах были выявлены синглетные и триплетные состояния хлорофилла in vitro. Возникновение синглетного возбужденного состояния следует из способности хлорофилла поглощать видимый свет и флуоресцировать. Различными методами было выявлено и триплетное состояние хлорофилла: зарегистрированы фосфоресценция и характерные спектры ЭПР триплетных состояний хлорофилла при низких температурах (77 К). Для хлорофиллов а и феофитина а и бактериохлорофилла триплетное состояние выявляется по спектрам триплет-триплетного поглощения, полученным с помощью флеш-фотолиза. Детальная характеристика синглетного и триплетного состояний и различных электронно-колебательных переходов в молекулах хлорофилла и родственных ему соединений дана в книге Г. П. Гуриновича, К. Н. Соловьева и А. Н. Севченко (см. литературу).

Какова роль синглетных и триплетных возбужденных состояний в фотохимии хлорофилла? Этот вопрос изучался на примере реакции фотовосстановления хлорофилла и родственных ему соединений в растворе. Можно привести ряд доказательств протекания этой реакции через триплетные состояния хлорофилла. Так, тетрапиррольные пигменты, у которых магний замещен на парамагнитный металл, эффективно тушащий фосфоресценцию, практически не фотовосстанавливаются. Реакция фотовосстановления ингибируется и добавками тушителей триплетно-возбужденных молекул — каротина или кислорода.

Соотносительный анализ роли триплетных и

синглетных возбужденных состояний хлорофилла в осуществлении первичной фотохимической реакции первой и второй фотосистем был проведен Ф. Ф. Литвиным с сотр. На основании параметров длительного послесвечения и низкотемпературной термолюминесценции листьев растений, расчетов констант скоростей и величин энергий активации свечения при использовании ингибиторов второй фотохимической системы (диурон) и дезактиваторов триплетных и синглетных состояний (хинон, кислород) предполагается, что первая фотохимическая реакция осуществляется через синглетное, а вторая — через триплетное возбужденное состояние хлорофилла.

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление