Главная > Разное > Фотобиология
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

3. ФОТОФИЗИКА И ФОТОХИМИЯ ЗРИТЕЛЬНОЙ РЕЦЕПЦИИ

В основе механизмов зрения лежит первичная фотохимическая реакция цис-транс-изомеризации ретиналя— «распрямление» сопряженной углеводородной цепи хромофора. Дис-гранс-изомеризация ретиналя протекает по одноквантовому (одноударному) механизму. Фотофизические процессы в ретинале, предшествующие фотохимической реакции, изучались многими авторами. Поглощение света ретиналем обусловлено скорее всего а не -переходом. Так, было показано, что константы скорости образования водородной связи альдегидной группы ретиналя с кислородом не различаются в основном и возбужденном состоянии (данные флеш-фотолиза). Иными словами, распределение электронной плотности у атома кислорода в основном и возбужденном состоянии одинаково, чего не было бы при передаче несвязывающего -электрона кислорода на делокализованную -орбиту. Об этом свидетельствуют также высокие значения коэффициента экстинкции 1 цис-ретиналя (около 104), что характерно для -поглощения.

В противоположность фотосинтезу фотофизическая стадия зрительной рецепции не включает процессов межпигментной миграции энергии, т. е. поглощенная ретиналем энергия не делокализуется в пределах палочки. Это следует из проявления дихроизма родопсина палочек в режиме интенсивного фотовыцветания при облучении поляризованным светом и высоких значений степени поляризации флуоресценции замороженных спиртовых растворов родственного ретиналю витамина Однако в пределах одной макромолекулы липохромопротеида имеет место миграция энергии от опсина к ретиналю с изомеризацией последнего. Квантовый выход изомеризации для составляет всего 0,26 (для видимой области спектра 0,66). Это указывает на низкую эффективность миграции энергии между ароматическими аминокислотами опсина и ретиналем, которая, по данным Эбрей, не превышает 12%.

Таким образом, все фотофизические и фотохимические события, лежащие в основе механизмов зрения, строго локализованы в месте поглощения кванта света.

Высказывается предположение, что первичная

фотохимическая реакция зрения (гис-транс-изомеризация ретиналя) протекает через триплетное состояние хромофора. Основанием для этого вывода служат квантовомеханические расчеты, показывающие, что в триплетном состоянии резко уменьшается энергетический барьер, разделяющий и транс-формы как ряда органических молекул, так и самого ретиналя. В пользу протекания цис-транс-изомеризации ретиналя через триплетное состояние свидетельствуют также и некоторые экспериментальные данные. В частности, обнаружена заселенность триплетных уровней ретиналя при его освещении. В опытах с использованием флеш-фотолиза было зарегистрировано триплет-триплетное поглощение ретиналя, которое не могло иметь места при низкой концентрации молекул в первом триплетном состоянии. Тот же вывод следует из анализа процессов миграции энергии -триплетное состояние ретиналя.

С помощью флеш-фотолиза показано также, что вероятность синглет-триплетной интеркомбинационной конверсии ретиналя составляет 60% от общей вероятности дезактивации синглетного возбужденного состояния. Это удовлетворительно согласуется с величиной квантового выхода фотоизомеризации ретиналя как в свободном состоянии, так и в составе родопсина. Однако предположению о триплетной природе реакции фото-изомеризацни ретиналя противоречат данные, полученные в лаборатории Ламолы: с помощью пикосекундной спектроскопии удалось оценить время цис-транс-превращения ретиналя (около 6 нс), которое оказалось слишком коротким по сравнению со временем жизни триплетных состояний.

Остановимся более подробно на квантовых выходах фотоизомеризации ретиналя. Квантовый выход превращения 11-цис—полностью транс-форма свободного ретиналя в гексановых растворах, по данным Уолда, сильно зависит от температуры. При температуре 25° С квантовый выход (при равен 0,2, в то время как при Последняя величина совпадает с усредненным для трех длин волн видимого света (450, 500, 550 нм) значением квантового выхода изомеризации хромофора родопсина в дигитониновом растворе при 20° С. Это совпадение скорее всего означает, что свойства

микроокружения хромофора, входящего в состав родопсина, и замороженной гексановой матрицы сходны. Еще более высокое значение квантового выхода обесцвечивания различных зрительных пигментов получены Дартнеллем и Кропфом — 0,67. Наконец, по данным Рипса и Уила, квантовый выход фотолиза родопсина в живом глазу человека близок к единице. Приведенные данные позволяют сделать вывод о том, что реальные значения квантового выхода цис-транс-фотоизомеризации ретиналя в родопсине чрезвычайно высоки и приближаются к единице.

Рис. 26. Спектральные изменения, сопутствующие фотолизу родопсина (Wald G., Brown P., 1958) Освещение проводилось при затем образец постепенно нагревался в темноте

Интересные данные о фотолизе родопсина в дигитониновых экстрактах получены М. А.

Островским с сотр. Оказалось, что квантовый выход реакции имел высокие значения (близкие к единице) и практически не зависел от температуры в интервале 20-5 °С.

Уменьшение температуры ниже —10°С сопровождалось резким (приблизительно в 100 раз) падением квантового выхода. Для интервала — квантовый выход также не зависел от температуры. Такая аномальная температурная зависимость указывает на важную роль структурного состояния околохромофорного окружения в определении эффективности фотохимической реакции. Скачкообразный харяктер падения квантового выхода может быть обусловлен кооперативной структурной перестройкой, например, в липидной фазе мембраны.

Итак, фотохимическая дезактивация возбужденной молекулы ретиналя, заключающаяся в ее цис-транс-изо-меризации, переходе 11-цисполностью транс-изомеры, осуществляется, по-видимому, через триплетное состояние. Между первичной фотохимической реакцией и гидролизом родопсина с образованием свободного ретиналя протекает ряд промежуточных темновых реакций. Эти реакции детально изучены в экспериментах с использованием импульсной спектрофотометрии и стабилизации промежуточных продуктов в определенных температурных интервалах (рис. 26). Тем не менее вопрос о количестве и последовательности образования промежуточных продуктов еще далек от окончательного разрешения. Ниже приводится одна из наиболее общепринятых схем превращения родопсина — модифицированная схема Уолда:

Первый продукт, возникающий из родопсина, — прелюмиродопсин. По сравнению с родопсином прелюмиродопсин обладает более длинноволновой полосой поглощения и более высокими значениями молярной экстинкции (максимум спектра поглощения при Прелюмиродопсин стабилен при температуре —195° С. Реакция родопсин — прелюмиродопсин очень быстрая и фотообратимая.

Обнаружен также альтернативный продукт гипсородопсин, возникающий из родопсина при температуре жидкого гелия в ходе облучения светом с длиной волны больше чем Этот продукт превращается в прелюмиродопсин или термально (выше -250°С), или фотохимически при облучении светом с

До последнего времени считалось, что именно на стадии родопсин—прелюмиродопсин и происходит изомеризация ретиналя из 11-цис- в полностью транс-форму. Однако результаты прямых измерений продолжительности этой реакции и кинетики процесса поставили под сомнение это уже установившееся положение, поскольку столь высокие скорости несвойственны реакции цыс-транс-изомеризации. Предполагается, что на данной стадии за счет вступления метального Н-атома при в водородную связь с азотом близлежащего имидазольного кольца и перевода азота Шиффовой связи в состав энеаминной -группы происходит нарушение планарности структуры ретиналя с образованием термодинамически неустойчивой структуры. Согласно другой точке зрения, причиной образования структуры, предрасположенной к трансформации, является разделение зарядов — перенос электрона от белка к ретиналю с образованием анион-радикала. Образование же транс-формы ретиналя происходит на последующих стадиях процесса, которые протекают в темноте и контролируются температурой. В ходе последовательных превращений спектры поглощения и люминесценции продуктов постепенно сдвигаются в коротковолновую сторону. Эти сдвиги обусловлены не химической модификацией ретиналя, а структурными перестройками в липохромопротеиде.

При увеличении температуры свыше —140° С прелюмиродопсин спонтанно превращается в люмнродопсин, имеющий максимум поглощения при 497, а флуоресценции — при Время полупревращения

этой реакции составляет Реакция характеризуется следующими активационными параметрами: ккал/моль и кал/моль град. Дальнейшее нагревание до —40° С сопровождается образованием метародопсина I (максимум спектра поглощения при 480, флуоресценции При комнатной температуре метародопсин образуется примерно за

Кинетика превращения люмиродопсин метародопсин I описывается на начальных стадиях уравнением реакции второго, а на конечных первого порядка. Это позволило Абрахамсону рассмотреть данную реакцию как энзиматический процесс, протекающий через образование опсин-субстратного комплекса: где образование бимолекулярная, а его распад — мономолекулярная реакция. При этом Абрахамсон предполагает, что люмнродопсин гетерогенен и состоит из трех форм: Каждая из форм люмиродопсина превращается в свою форму метародопсина I с различными константами скоростей перехода:

Процесс характеризуется высокими значениями энтропии кал/моль-град) и энтальпии моль) активации.

Следующий продукт — метародопсин II — возникает из метародопсина I при температуре, превышающей —15° С (максимум спектра поглощения при 380, флуоресценции — На этой стадии происходят наиболее существенные изменения конформации зрительного пигмента, о чем свидетельствуют следующие факты:

1) значительный батохромный сдвиг (почти

2) возникновение чувствительности к борогидриду натрия, атакующему альдиминную связ, что указывает на переход альдиминной группировки из гидрофобной в гидрофильную область; 3) экспонирование двух-трех сульфгидрильных групп в молекуле опсина; 4) высокие значения энтальпии ккал/моль) и энтропии кал/моль-град) активации, приближающиеся к термодинамическим параметрам денатурации белков.

Показано также, что эффективность превращения метародопсин зависит от белок-липидных взаимодействий. Так, в озвученной суспензии мембран дисков быка процесс протекает при 39° С по кинетике реакции первого порядка с а в дигитониновых экстрактах — по сложной кинетике, которую можно представить как наложение нескольких процессов, описываемых кинетикой реакций первого порядка. Наиболее быстрый компонент имеет

Все стадии от образования прелюмиродопсина до иозникновения метародопсина II легко обратимы в темноте: обратные реакции инициируются понижением температуры.

Кроме метародопсина II в результате темнового превращения зрительного пигмента образуются метародопсин III, или парародопсин/ (максимум спектра поглощения при 465 нм), две формы УУ-ретинилиденопсина с максимумами спектров поглощения при соответственно, опсин и свободный полностью транс-ретиналь. Эти финальные стадии превращения родопсина еще недостаточно изучены. Показано только, что в молекуле хромопротеида на стадии превращения метародопсина I в метародопсин II экспонируется еще одна сульфгид-рильная группа, а на стадии метародопсин -рети-нилиденопсин происходит экспонирование Шиффовой связи. До сих пор дискутируется вопрос о том, можно ли включать метародопсин III и в общую цепь превращений или они являются лишь ее ответвлениями. Не вызывает, однако, сомнения тот факт, что конечные продукты фотолиза зрительного пигмента, ответственные за все дальнейшие события, — это свободный транс-ретиналь и опсин.

Известно, что в наружных сегментах палочек содержится специальный фермент — ретинолдегидрогеназа, который превращает ретиналь в ретинол (витамин

Характеризуя процесс в целом, следует подчеркнуть, что в интервале физиологических температур все промежуточные реакции протекают чрезвычайно быстро Например, по данным флеш-фотолиза, время образования и жизни прелюмиродопсина с соответственно, а время полупревращения метародопсин -метародопсин II составляет около

Таким образом, природа вторичных темновых реакций в комплексе опсин — липид—ретиналь, вызываемых первичной цис-транс-фотоизомеризацией ретиналя, сводится к цепи последовательных конформационных перестроек, приводящих к изменению микроокружения хромофора, и заканчивается его отрывом от белка. Чрезвычайно существенно, что рассмотренная последовательность превращений зрительного пигмента характерна не только для дигитониновых экстрактов, но и для суспензии

наружных сегментов, изолированной сетчатки и даже глазного бокала.

Перейдем теперь к рассмотрению механизмов регенерации зрительного пигмента из продуктов фотолиза. Различают фотохимическую и биохимическую регенерации. Фотохимическая регенерация, заключающаяся в образовании родопсина при поглощении света продуктами фотолиза, описана для прелюмиродопсина, люмиродопсина, метародопсина I и метародопсина II. На стадиях прелюмиродопсина и люмиродопсина, которые не сопровождаются существенными конформационными перестройками опсина, фоторегенерация происходит сравнительно легко. Однако конверсия метародопсина I в родопсин заметно контролируется температурой: процесс идет при —20° С, но резко замедляется при —65 и —195° С. Более того, в результате регенерации образуется не исходный продукт родопсин, а две его изохромные формы. При близких спектральных свойствах эти формы родопсина обладают различной температурной стабильностью.

Биохимическая регенерация родопсина изучена слабо. Совершенно очевидно, что для такой регенерации необходимо, по крайней мере, восстановление исходной конформации опсина, окисление ретинола до ретиналя и реизомеризация транс-ретиналя в -цмс-форму. После полного выцветания зрительного пигмента в сетчатке глаза животных накапливается свободный ретинол в виде эфира жирной кислоты. В опытах с гомогенатами обесцвеченной сетчатки глаза лягушки, крысы и быка было обнаружено, что весь транс-ретинол постепенно превращается в -цмс-форму. Это превращение осуществляется с помощью специального фермента опсин-ретинальизомеразы. Обнаруженная в сетчатке глаза лягушки и быка опсинретинальизомераза не способна катализировать изомеризацию транс-ретинола. Поэтому допускается, что стадии изомеризации предшествует окисление ретинола до ретиналя, которое осуществляется с помощью ретинолдегидрогеназы. Предполагается также, что реизомеризация ретиналя может активироваться светом. Заключительный этап ресинтеза — присоединение -мс-ретиналя к опсину — представляет собой спонтанную реакцию, протекающую при

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление