Главная > Разное > Фотобиология
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

4. МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ ФОТОХИМИЧЕСКИХ ПРЕВРАЩЕНИЙ РОДОПСИНА В ФОТОРЕЦЕПТОРНЫЙ СИГНАЛ

Считается общепринятым, что фотохимические превращения родопсина триггируют ионные перемещения через мембрану фоторецепторной клетки, резко изменяя мембранный потенциал. Генерация потенциала при освещении палочек и колбочек зарегистрирована в прямых экспериментах с помощью микроэлектродной техники. Время между вспышкой света и возникновением рецепторного потенциала — порядка миллисекунды. Наличие латентного периода фоторецепторного потенциала свидетельствует о том, что электрофизиологическому ответу предшествует ряд промежуточных темновых реакций. Формы рецепторных потенциалов палочек и колбочек несколько различаются между собой. Для колбочек характерны крутые передние и задние фронты потенциала в ответ на включение и выключение света, для палочек — крутой передний и пологий задний фронты потенциала. Есть все основания считать, что именно мембранный фоторецепторный потенциал представляет собой первичный нейрофизиологический сигнал. Следовательно, от единственной молекулы родопсина начинается сложная цепь событий, приводящих к изменению целой зрительной клетки и возникновению зрительного сигнала.

Рассмотрим события, происходящие в период между фотохимической и нейрофизиологической стадией зрительного акта. Из всех продуктов фотолиза родопсина первостепенная роль отводится метародопсину По-видимому, именно этот продукт инициирует рецепторный сигнал. Основанием для такого заключения послужили следующие факты.

Как уже отмечалось, наиболее значительные конформационные перестройки опсина происходят как раз при образовании метародопсина II. В отличие от позвоночных у беспозвоночных животных конечным продуктом фотолиза родопсина является не ретиналь+опсин, а метародопсин II. Наконец, специальные измерения показали, что время между вспышкой света и образованием метародопсина II удовлетворительно соответствует времени возникновения так называемого раннего

рецепторного потенциала в сетчатке глаза, биологическое значение которого рассмотрим более детально.

Ранний рецепторный потенциал, открытый в 1964 г. Брауном и Мураками, по ряду свойств отличается от обычных биоэлектрических потенциалов. Он обладает очень коротким латентным периодом, не свойственным «ионным» потенциалам, и низкой амплитудой (1—4 мВ). Потенциал носит бифазный характер и состоит из двух волн: позитивной и негативной Амплитуда потенциала градуально растет при увеличении интенсивности света. Непосредственно с уровнем метаболизма потенциал не связан. Поскольку компонент раннего рецепторного потенциала возникает при температурах ниже —40° С, его образование должно быть обусловлено продуктами, предшествующими метародопсину Как известно, при этой температуре превращение родопсина останавливается на стадии люмиродопсина. Поэтому предполагается, что отражает превращение прелюмиродопсин — люмиродопсин. В свою очередь компонент раннего рецепторного потенциала обусловлен переходом метародопсин I — метародопсин II. Длительность и температурная зависимость хорошо коррелируют с аналогичными параметрами распада метародопсина Характерно, что спектры действия раннего рецепторного потенциала совпадают со спектрами поглощения зрительного пигмента. Наиболее вероятно, что ранний рецепторный потенциал не связан с ионными потоками через мембрану, а отражает конформационные перестройки в липопротвидном комплексе зрительного пигмента, изменяющие микромозаику электрических зарядов. Косвенным подтверждением конформационной природы раннего рецепторного потенциала может служить исчезновение его в фоторецепторных мембранах с дезориентированным и денатурированным зрительным пигментом.

Следовательно, к истинному, ионному, рецепторному потенциалу приводят конформационные перестройки родопсина, которые затем распространяются на всю мембрану. В пользу структурных перестроек мембран наряду с возникновением раннего рецепторного потенциала свидетельствуют и другие данные. экстрагируемость липидов гексаном из наружных сегментов палочек сильно различается у темновых и обесцвеченных

препаратов. Наименьшее количество липидов извлекается из мембран, содержащих интактный родопсин, наибольшее — из освещенных мембран, содержащих метародопсин II. Мембраны с метародопсином I по экстрагируемости липидов занимают промежуточное положение. Вполне понятно, что степень экстракции определяется доступностью липидов для малополярного растворителя и интенсивностью межмолекулярных взаимодействий липид — мембранная матрица. Иначе говоря, изменения в экстрагируемости липидов указывают на структурную перестройку мембраны.

В последнее время получены и более прямые доказательства индукции светом структурных перестроек в мембранах дисков наружных сегментов палочек. Особенно показательны в этом отношении данные электронномикроскопической криофрактографии, полученные Абрахамсоном с сотр. Установлено, что распределение и количество внутримембранных частиц на сколах сильно изменяется у обесцвеченных образцов мембран. Аналогичный вывод следует и из результатов проведенного Вашингтоном рентгеноструктурного анализа, показавшего, что свет изменяет «плавучесть» родопсина в жидком липидном бислое: в обесцвеченном состоянии макромолекулы родопсина как бы погружаются в липидную фазу, в темновом — всплывают. Эти эксперименты послужили толчком для исследования структурного состояния липидной фазы в темновых и обесцвеченных мембранах дисков. Однако существенных изменений текучести липидной фазы в ходе индуцированной светом структурной перестройки обнаружить не удалось. Так, было показано, что параметр упорядоченности, определенный для спин-меченых в 6, положениях стеариновых кислот (ЭПР-зонды), и микровязкость гидрофобного ядра мембраны (гидрофобный флуоресцентный зонд -гексатриен) остаются после обесцвечивания мембран неизменными. Эти результаты свидетельствуют о том, что в индуцированную светом структурную перестройку мембран дисков вовлечена преимущественно не липидный, а белковый компонент мембраны. По-видимому, в основе структурной перестройки лежат изменения белок-липидных и белок-белковых взаимодействий в поверхностных слоях мембраны.

Прямым следствием структурных перестроек мембраны является изменение проницаемости для потенциал-образующих ионов и генерация позднего рецепторного потенциала. В этой связи очень показательны опыты Е. Е. Фесенко с сотр., которым удалось зарегистрировать светозависимое изменение сопротивления лецитин-холестериновых мембран в присутствии фрагментов наружных сегментов палочек сетчатки. В ответ на короткий импульс видимого света наблюдалось резкое увеличение проводимости мембраны, причем постоянная времени эффекта в пределах ошибки соответствовала времени превращения метародопсина II.

Рассмотрим, как распределены основные потенциал-образующие ионы в наружном сегменте палочки. По данным Этингоф и Бонтинга, в наружных сегментах палочек быка содержится около Часть ионов находится в свободном состоянии, а часть связана с фосфолипидами мембраны. Ионы во внутридисковом, междисковом и внеклеточном пространстве распределены неравномерно. Так, по данным Бонтинга, во внутридисковом пространстве много и очень мало а в междисковом пространстве, наоборот, мало и много Известны данные, свидетельствующие о том, что наружная мембрана палочки проницаема для ионов и мало проницаема для ионов Благодаря этому по электрохимическому градиенту ионы Na+ входят в наружный сегмент. В то же время концентрация ионов Na+ не достигает равновесного состояния вследствие их выталкивания наружу с помощью оубаин-чувствительной Na+-, К+-АТФ-азы, локализованной во внутреннем сегменте. Как следствие, от внутреннего к наружному сегменту снаружи палочки течет темновой натриевый ток. Действительно, если палочку обработать оубаином, концентрация Na+ по обе стороны мембраны выравнивается и темновой ток исчезает.

Итак, в отличие от нервных и мышечных клеток наружная мембрана палочек в темноте не поляризована, а в значительной мере деполяризована. Небольшой по величине мембранный потенциал палочки имеет положительное значение и составляет (у нервных и мышечных клеток или волокон

Следовательно, в темноте мембрана палочки как бы возбуждена. Характерно, что мембранный потенциал палочек обусловлен в основном движением ионов а не как у других клеток.

Известны данные, что при освещении палочки происходит поглощение из цитоплазмы, вход во внутридисковое пространство ионов Na+ и выход из внутридискового пространства в цитоплазму ионов По всей видимости, перемещения ионов связаны с изменением конформации мембран дисков. Освещение приводит также к значительному уменьшению проницаемости наружной мембраны палочки для ионов Na+ и увеличению ее электрического сопротивления. По данным Бейлора и Фьюотеса, электрическое сопротивление фоторецепторных клеток черепахи на свету возрастает с 17 до Считается, что основной причиной этого может быть закрытие Na+-каналов под влиянием особых медиаторов, выделяющихся при конформационных перестройках мембран дисков. Такими медиаторами, видимо, могут быть ионы Са2+ и циклический гуанозинмонофосфат. Уменьшение проницаемости наружной мембраны для ионов снижение их содержания в цитоплазме у ее внутренней поверхности приводят к гиперполяризации мембраны, характерной для состояния покоя у нервных и мышечных клеток. По-видимому, волна гиперполяризации распространяется по наружной мембране до базального пресинаптического участка палочки, где происходит возбуждение биполярных нервных клеток (рис. 27).

Приведем некоторые экспериментальные факты, подтверждающие эту гипотетическую схему. В опытах Коренброта и Кона ( выполненных на «мягко» отделенных целых наружных сегментах палочки, обнаружено, судя по характеру осмотического ответа сегмента на действие света в растворах калиевых и натриевых солей, что мембрана остается малопроницаемой для ионов в то время как проницаемость для ионов Na+ значительно уменьшается. Этими же авторами показано, что один поглощенный фотон, индуцирующий фотохимическую трансформацию одной молекулы родопсина, уменьшает темновой ток в палочке весьма значительно — на 1—3%. Так как темнорой ток соответствует входу в

палочку около 109 ионов Na+ в секунду, это должно означать, что одно фотохимическое событие сопровождается приостановкой входа в наружный сегмент около ионов Выявлена также линейность между уменьшением темнового тока и числом поглощенных фотонов. При высоких интенсивностях наблюдается отклонение от линейности вплоть до насыщения натриевого декремента при 200 поглощенных палочкой фотонах. Вещества, ингибирующие и синтез макроэргических соединений (цианиды), не влияли на изменение проницаемости под действием света. Это означает, что свет влияет не на активный, а на пассивный транспорт ионов натрия.

Рис. 27. Схема возникновения рецепторного потенциала в палочках сетчатки

В темноте все Ыаканалы в наружной мембране палочкн открыты — ток большой; при освещении каналы закрываются, ток уменьшается и мембрана гиперполяризуется

Обнаруженное Коренбротом и Коном уменьшение пассивного транспорта ионов натрия удовлетворительно коррелирует с увеличением электрического сопротивления клеточной мембраны.

Решающая роль ионов Na+ в возникновении мембранного потенциала подтверждается опытами японского исследователя Хамасаки, согласно которым изолированная сетчатка глаза лягушки не обнаруживает обычной электро-ретинограммы при отсутствии ионов Na+ в наружной среде. В дальнейшем было показано, что амплитуда рецепторного потенциала увеличивается прямо пропорционально логарифму концентрации Сходные по смыслу данные приводят также Арден и Эрнст. Введение ионов Na+ внутрь палочки уменьшало величину световой гиперполяризации мембраны. Последующее восстановление исходного натриевого градиента путем добавления ионов

Na+ в окружающую среду приводило к нормализации мембранного потенциала.

Рассмотрим теперь более подробно возможные механизмы трансмиссии сигнала от дисков к наружной плазматической мембране. Если трансмиссия сигнала осуществляется химическим путем, то медиатор должен обладать коэффициентом диффузии в водной среде порядка и его равновесная концентрация в палочке, имеющей диаметр должна устанавливаться за время менее Медиатор должен обладать также высоким сродством к структурам, формирующим каналы пассивной проницаемости ионов в мембране. Этим условиям в фоторецепторной клетке удовлетворяют ионы Первые данные об ионах Са2+ как медиаторе передачи информации от дисков к наружной мембране палочки были получены Иошиками и Хэггинсом. Оказалось, что увеличение концентрации Са2+ от 1,4 до в окружающей среде имитирует действие света. С другой стороны, при помещении палочек в раствор с низкой концентрацией Са2+ значительно искажается световая зависимость фотоответа: для возникновения сигнала необходима энергия, в 10 раз превышающая обычную. Более того, в присутствии кальциевого ионофора под действием которого концентрация Са2+ по обе стороны мембраны быстро выравнивается, уже низких концентраций достаточно, чтобы подавить темновой ток.

Предполагается, что после освещения Са2+ выходит из дисков, в которых он накапливался в темноте. Прямыми измерениями установлено, что концентрация Са2+ в дисках составляет величину порядка а в междисковом пространстве — освещение вызывает увеличение концентрации Са2+ в междисковом пространстве на величину что соответствует в пересчете на один поглощенный фотон 3—300 ионам

К сожалению, еще окончательно не выяснен вопрос о механизмах темнового накопления дисками ионов а также светового их высвобождения. По мнению одного из ведущих специалистов в области фотобиологии зрения Бонтинга, в мембранах дисков представлены два типа сайтов, обладающих высоким и низким

сродством к Ca2+. Большую долю связывания обеспечивают сайты низкого сродства (фосфолипиды?). Сайты высокого сродства могут быть элементами системы транслокации На возможное участие системы АТФ-аз в темновом накоплении Са2+ указывает зависимость эффективности процесса от экзогенной АТФ.

Высказывается также предположение, что в качестве химического медиатора структурного сигнала может выступать циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), в присутствии которого проницаемость бислойных липидных мембран для ионов Na+ увеличивается. Однако в последнее время в качестве одного из возможных кандидатов на роль медиатора сигнала от дисков к наружной мембране рассматривается не циклический аденозинмонофосфат, а циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ), концентрация которого в наружных сегментах примерно на два порядка превышает концентрацию цАМФ. В мембранах наружных сегментов обнаружены и ферменты метаболизма цГМФ - гуанилатциклаза и фосфодиэстераза. Показано, что после освещения концентрация цГМФ в наружных сегментах сильно уменьшается, причем этот эффект связан не с ингибированием гуанилат-циклазы, а обусловлен стимуляцией фосфодиэстеразы. Спектр действия этого процесса полностью совпадает со спектром поглощения родопсина. Поскольку изолированная фосфодиэстераза, согласно данным Битенского с сотр., каким-либо ощутимым поглощением в видимой части спектра не обладает и светом не активируется, это указывает на участие эффектов мембранного дальнодействия в фотоиндуцированной стимуляции фосфодиэстеразы.

Подсчитано, что при фототрансформации одной молекулы родопсина активируется одна молекула фосфодиэстеразы, которая, в свою очередь, при физиологических условиях гидролизует за лишь восемь молекул цГМФ. Если принять, что в адаптированном к темноте наружном сегменте имеется около 40 000 молекул цГМФ, то очевидно, что только снижением концентрации цГМФ в наружном сегменте передачу сигнала от дисков к наружной мембране объяснить нельзя.

Следует отметить, что наряду с рассмотренной схемой «вторичных процессов рецепции» можно

представить себе и другие механизмы темнового усиления. В основе одного из них, например, может лежать передача структурного сигнала от диска к наружной мембране в виде волны конформационного возмущения. На эту мысль наводит факт, описанный Хэггинсом: изменение проницаемости наружной мембраны наблюдается только в области, непосредственно примыкающей к облученным дискам. И наконец, по мнению ряда исследователей, родопсин входит в состав не только дисков, но и наружной мембраны, следовательно, изменение ее проницаемости может быть обусловлено прямыми фотоэффектами.

После возникновения рецепторного потенциала в зрительной клетке в последующие события вовлекается пресинаптическая область палочек и колбочек и контактирующие с ними отростки горизонтальных и биполярных нервных клеток. На эти нервные клетки сигнал передается с помощью медиатора ацетилхолина. В свою очередь биполярные клетки образуют синаптические связи с амакриновыми и ганглиозными клетками. Прямой афферентный путь сформирован из фоторецепторной биполярной и ганглиозной клеток. Горизонтальные и амакриновые нервные клетки обеспечивают коллатеральное, резервное взаимодействие. На уровне нервных клеток и их волокон зрительный сигнал передается с помощью электрического потенциала действия спайка, а в местах вторичных синапсов — с помощью ацетилхолина.

Резюмируя сказанное, последовательность событий, лежащих в основе фоторецепции, можно представить так:

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление