4. ДИМЕРИЗАЦИЯ ТИМИНА

В 1958 г. Бькжерс, Иильстра и Берендс обнаружили, что при ультрафиолетовом облучении замороженных водных растворов тимина образуется фотопродукт, который позднее хроматографически был выделен в чистом виде и по молекулярному весу, элементарному составу, кристаллографическим, ИК-спектроскопическим свойствам и растворимости идентифицирован как циклобутановый димер. Аналогичные димеры образуются в однонитевых полинуклеотидах и ДНК.

Смысл реакции фотодимеризации заключается в разрыве -двойной связи у обоих партнеров и образовании циклобутанового кольца:

Как прямая, так и обратная реакции имеют чисто фотохимическую природу и не требуют термической активации: в замороженных растворах тимина в интервале от 0 до —196° С скорость реакций не изменяется, т. е.

Из облученных модельных соединений, например тимидил-тимидина, с помощью тонкослойной хроматографии выделены четыре типа димеров с циклобутановым кольцом — два цис- и два транс-изомера:

Однако при облучении ДНК обнаруживается лишь один цис-димер типа Под действием коротковолнового света димеры мономеризуются. Поскольку спектры поглощения димеров и мономеров, перекрываясь, сильно различаются между собой (рис. 45), при длительном облучении для каждой волны возбуждающего света в спектральном интервале перекрытия устанавливается динамическое равновесие, при котором скорость прямой равна скорости обратной реакции.

Рис. 45. Спектры поглощения тимииа облученного тимина (2), тимииового димера (3) и спектр действия реверсии димер - мономер

Так, известно, что для отношение экстинкций димер/мономер в 1000 раз меньше, чем для Поэтому применение «насыщающего» облучения после как показали Сетлоу и

Кариэ, резко уменьшает концентрацию димеров в ДНК и политимидиловой кислоте. Изменение стационарного равновесия между димерной и мономерной формами в политимидиловой кислоте при переходе от длинноволнового к коротковолновому облучению иллюстрируется следующей схемой:

Спектры действия образования и разрушения димеров в политимидиловой кислоте, как и следовало ожидать, близки по форме к соответствующим спектрам поглощения, хотя и имеют некоторые различия, о которых мы будем говорить ниже.

Вследствие бимолекулярного характера реакции фотодимеризации ее квантовый выход сильно зависит от концентрации и степени взаимоориентации мономеров в момент возбуждения одного из них. При идеальном стереометрическом соответствии мономеров (кристаллы моногидратов тимина) квантовый выход прямой реакции равняется 1. По мере нарушения этого соответствия квантовый выход реакции уменьшается для политимидиловой кислоты до 0,02, для дитимидиловой до 0,01, для тимидил-тимидина до 0,003. Именно вследствие более благоприятной ориентации нуклеотидов димерообразование в политимидиловой кислоте при 77 К протекает в 5 раз быстрее, чем при 298 К. Процесс, однако, быстро прекращается и только после переориентации мономерных звеньев при замораживании — оттаивании образца идет дальше. Ориентационными нарушениями объясняется и резкое падение выхода димеров при температуре плавления нативной ДНК, которое не наблюдается у предварительно денатурированной ДНК.

Число образующихся в ДНК димеров тимина определяется количеством расположенных рядом тиминовых остатков. По данным Корнберга с сотр., в ДНК М. lysodeicticus в такие пары включено около 1,8, а в ДНК фага Т2-11% всего тимина. В соответствии с

этим в ДНК М. lysodeicticus димеризуется 1,2, а в ДНК фага всего тимина.

Вероятность образования димеров зависит также от вторичной и третичной структур ДНК. Подтверждением этому служат опыты Г. Б. Завильгельского и сотр., в которых была выявлена отчетливая корреляция между квантовым выходом димеризации тимидил-тимидина и взаимоориентацией тимина, а также выходом образования летальных димеров в инфекционной фаговой ДНК и конформацией макромолекулы, контролируемой температурой и денатурирующими веществами. По расчетам японского исследователя Нагата, условия для димеризации наиболее благоприятны у тех конформаций ДНК (из всех возможных), у которых соседние остатки тимина ориентированы друг к другу под углом 36°.

Перейдем теперь к рассмотрению имеющихся данных по фотофизике процесса. Известны убедительные экспериментальные доказательства того, что предшественник фотодимеров тимина — первое триплетное состояние основания: 1) триплетные тушители парамагнитные ионы) тормозят фотодимеризацию тимина; 2) к тому же результату приводит уменьшение заселенности триплетных уровней тимина (тест — тушение фосфоресценции) при триплет-синглетной миграции энергии с тимина ДНК на краситель профлавин; 3) димеры образуются в разбавленных растворах тимина, где временные промежутки между столкновениями значительно превышают время жизни их возбужденных синглетных состояний но соизмеримы с временем жизни триплетов ; 4) избирательное заселение триплетных уровней при триплет-триплетной миграции энергии от ацетофенона к тимину ДНК в растворе, а также в интактных фагах приводит к образованию димеров.

Однако на основании опытов по ингибированию димерообразования в ДНК хлороквином, сопоставления спектральных зависимостей эффективности торможения димерообразования в ДНК этидиумбромидом (акцептор энергии) и квантовых выходов его сенсибилизированной основаниями флуоресценции Сазерлендом было высказано предположение о том, что часть димеров образуется «синглетным» путем.

Все же. к настоящему времени наиболее аргументирована точка зрения о преимущественно «триплетном» образовании димеров в ДНК при физиологических условиях. Отмеченное Сазерлендом некоторое несовпадение спектра действия димеризации со спектром поглощения тимина, заключающееся в возрастании квантового выхода фотохимической реакции с уменьшением длины волны света, может быть объяснено более эффективным заселением триплетных уровней тимина с высоких колебательных подуровней синглетного возбужденного состояния. Это хорошо согласуется с аналогичной зависимостью от длины волны облучения константы скорости интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние, полученной методом флеш-фотолиза.

В работах Айзингера с сотр. методом ЭПР было показано, что при ультрафиолетовом облучении в ДНК возникают свободные радикалы тимина. Однако ингибиторы свободнорадикальных реакций не оказывали существенного влияния на процесс фотодимеризации. По всей видимости, роль свободнорадикальных состояний в образовании димеров тимина невелика и предшественником димера является все же не свободный радикал тимина, а его триплетное состояние. Можно думать в связи с этим, что сигнал ЭПР регистрируется скорее всего от тех тиминовых оснований, для димеризации которых нет стерических условий.

Есть все основания думать, что димеры образуются непосредственно из триплетного эксимера. Минуя стадию лабильного химического фотопродукта, эксимер, по-видимому, прямо превращается в стабильный фотохимический продукт — димер.

Как отмечалось выше, замыкание двух ковалентных -связей между двумя молекулами тимина происходит в пятом и шестом положениях. Действительно, квантовомеханические расчеты показывают, что именно между пятым и шестым углеродными атомами в первом возбужденном состоянии наиболее высокая концентрация неспаренных электронов (спиновая плотность). При этом значительно уменьшается и подвижный порядок связи 5—6: двойная связь приближается к одинарной. Это способствует ее «разрыву» и замыканию

межтиминовых связей благодаря «электронным вакансиям» (высокой спиновой плотности). По данным Пюльмана, способность различных пиримидинов к димеризадии удовлетворительно коррелирует с рассчитанными для них квантовомеханическими характеристиками. С помощью приближенного метода расчета (самосогласованное поле) В. И. Данилов пришел к выводу, что наилучшие условия для димеризадии создаются в триплетном, а не в синглетном состоянии. Это хорошо согласуется с приведенными выше экспериментальными данными.

Итак, большинство экспериментальных данных свидетельствует о триплетном механизме образования тиминовых фотодимеров.

Рис. 46. Кривые потенциальной энергии взаимодействия между молекулами тимина (Lamola А., 1968)

Тем не менее вероятность протекания реакции фотодимеризации через синглетное состояние, особенно при благоприятных физических и физико-химических условиях, остается достаточно высокой.

По мнению Ламолы, характер взаимодействия между двумя молекулами тимина при условии оптимального стерического соответствия зависит от расстояния между партнерами (рис. 46). При расстоянии наблюдается экситонное взаимодействие с заселением обоих уровней экситонного состояния. Если молекулы сближаются еще больще из нижнего

экситонного состояния возникают эксимеры, которые переходят прямо в димер.