Главная > Разное > Фотобиология
<< Предыдущий параграф
Следующий параграф >>
<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Макеты страниц

5. ТРИПТОФАНОВАЯ ФОТОИНАКТИВАЦИЯ

Триптофановая фотоинактивация белков в растворе и в пленке при облучении УФ-светом с длиной волны 260—320 нм осуществляется по одноквантовому, одноударному механизму. В пользу этого свидетельствуют экспоненциальный характер дозных кривых и взаимозаменяемость интенсивности и времени облучения (соблюдение закона Бунзена — Роско). Триптофановая инактивация белков инициируется не триплетными, а синглетными электронно-возбужденными состояниями

хромофоров. Этот вывод следует из пропорциональности между концентрацией синглетных возбужденных состояний и степенью инактивации. Миграционная «откачка» энергии с синглетных уровней триптофанилов у трипсина на краситель флуоресцеин, а у фибриногена — на диметил-аминонафталинсульфанилхлорид сопровождается соответствующим уменьшением квантового выхода инактивации белков. В противоположность этому изменение заселенности триплетных уровней триптофанилов белка в результате индуктивно-резонансной миграции энергии триптофанил - хризоидин и сульфонамид - триптофанил не влияет на фоточувствительность белков.

Более того, даже при низких температурах при которых стационарная концентрация «триплетов» и, следовательно, вероятность триплетной фотоинактивации на несколько порядков выше, чем при комнатных, сохраняется одноквантовость процесса. В этих же условиях равные дозы прерывистого и непрерывного облучения оказываются одинаково эффективными, хотя в последнем случае условия более благоприятны для триплетной фотохимии.

Характерно, что и сам фотолиз триптофанилов (их фотовыцветание, регистрируемое по тушению флуоресценции) в белках также протекает по одноквантовому одноударному механизму.

Для некоторых белков, однако, полулогарифмическая зависимость степени фотолиза триптофанилов от дозы УФ-облучения описывается не одной, а двумя прямыми с изломом на начальных стадиях фотолиза. Это указывает на гетерогенность триптофанилов по фоточувствительности — «быстрые» и «медленные» триптофанилы (Л. X. Эйдус, Т. Н. Калабухова).

Итак, при физиологических условиях именно синглетное возбужденное состояние триптофанила в белках является, по-видимому, непосредственным предшественником фотопродуктов, которые приводят к инактивации макромолекулы.

В опытах Ю. А. Владимирова с сотр. убедительно показано, что триптофан может участвовать в двух реакциях фотохимического разрушения. Реакция 1 характерна для свободной аминокислоты в растворе, а реакция 2 — для остатков триптофана в белке. Хотя обе реакции приводят

к тушению триптофановой флуоресценции (образующиеся фотопродукты не флуоресцируют в свойственной для аминокислоты спектральной области), по своей природе они существенно различаются между собой. Во-первых, квантовый выход реакции 2 мало зависит от содержания кислорода, а реакция 1 резко усиливается в его присутствии; во-вторых, скорости реакций 1 и 2 по-разному зависят от концентрации водородных ионов в среде (pH); в-третьих, стабильные фотопродукты реакций обладают неодинаковыми спектрами поглощения. Это означает, что реакции 1 и 2 приводят к образованию различных стабильных фотопродуктов.

По-видимому, в реакции 1 разрывается пиррольное (но не бензольное) кольцо индола. При этом образуются формилкинуренин, кинуренин, оксикинуренин и окси-антраниловая кислота — конечный стабильный продукт фотодеградации триптофана в обычных условиях.

Реакция 2, судя по спектрам поглощения, не сопровождается разрывом индольного кольца, а приводит к образованию ковалентной связи (сшивки) между иминным азотом индола и соседними группами белковой макромолекулы. В пользу этого свидетельствуют исчезновение полосы поглощения -группы в инфракрасном спектре у глицил-триптофана и тушение флуоресценции (фотовыцветание). Однако этот конечный стабильный фотопродукт триптофана, который, по-видимому, приводит к фотоинактивации белков, не выделен и его химическая природа пока не ясна.

Образованию конечного стабильного фотопродукта предшествует возникновение ряда первичных (промежуточных) лабильных фотопродуктов свободнорадикальной природы. Появление в белках при УФ-облучении свободных радикалов триптофана зарегистрировано с помощью методов электронного парамагнитного резонанса, фотохемилюминесценции и фототермолюминесценции. Определение их природы стало возможным благодаря использованию низких температур, способствующих накоплению и стабилизации лабильных фотопродуктов.

С помощью различных методических приемов и подходов удалось выяснить, что в этих условиях основной первичной фотореакцией триптофана в белке является

его фотоионизация — отрыв электрона от азота имино-группы с образованием катион-радикала и сольватиро-ванного электрона по схеме

При отрыве протона от катион-радикала возникает нейтральный радикал: Другой путь дезактивации катион-радикала — его взаимодействие с ОН-ионами с образованием реакционных ОН-аддуктов.

Нейтральные радикалы триптофана зарегистрированы Гроссвейнером с сотр. в различных белках методом флеш-фотолиза. Данные радикалы характеризуются переходным поглощением с максимумом при Их образование протекает с участием иминогруппы индоль-ного кольца, так как у -метилтриптофана переходное поглощение при 510 нм не регистрируется.

Наряду с данными флеш-фотолиза индикатором свободнорадикальных продуктов и их превращений в УФ-облученных белках служит рекомбинационное послесвечение, возникающее при взаимодействии катион-радикала с сольватированным электроном. Этот процесс значительно ускоряется при подогреве образца или подсветке желтым светом, поглощаемым сольватированными электронами. Последовательность событий при рекомбинации промежуточных лабильных фотопродуктов может быть проиллюстрирована следующими реакциями:

Рассмотрим механизм образования катион-радикала Фотоионизация триптофана в замороженных водно-буферных растворах протекает по одноквантовому механизму. Это следует из линейной зависимости интенсивности термолюминесценции от интенсивности возбуждающего света и интенсивности индуцированной видимым светом люминесценции как от интенсивности возбуждающего света, так и интенсивности подсветки в желтой области спектра. Увеличение темнового

интервала между возбуждающим (ультрафиолетовым) и индуцирующим (желтым) импульсами в пределах времени жизни триплетов триптофана (6 с) не приводило к возрастанию интенсивности индуцированной люминесценции. Поскольку интенсивность индуцированной люминесценции является показателем концентрации катион-радикалов это указывает на образование не через триплетное, а через синглетное возбужденное состояние триптофана. Однако в сильнощелочных растворах триптофана зависимость светосуммы термолюминесценции и поглощения сольватированных электронов при от интенсивности возбуждающего света характеризуется квадратичной зависимостью где светосумма термолюминесценции или оптическая плотность сольватированных электронов, а интенсивность возбуждающего света. Иными словами, в сильнощелочных замороженных растворах фотоионизация представляет собой двухквантовый процесс, в котором второй квант поглощается, по-видимому, триплетной молекулой триптофана. При этом электрон отрывается от молекулы триптофана, находящейся во втором триплетном электронно-возбужденном состоянии.

Для водно-солевых замороженных растворов триптофана показатель степени в приведенной выше формуле варьировал от 1 до 2 в зависимости от способа приготовления образца: наблюдалось «смешивание» одноквантовой и двухквантовой фотохимии в различных пропорциях.

Итак, электрон может успешно отрываться как от синглетной, так и от триплетной возбужденной молекулы триптофана в зависимости от условий микроокружения — матрицы.

На первый взгляд возможность отрыва электрона от синглетной возбужденной молекулы триптофана противоречит законам термодинамики. Известно, что энергия ионизации ароматических соединений в вакууме обычно равняется а нижнему колебательному подуровню синглетного возбужденного состояния триптофана соответствует энергия Поэтому кажется, что возбужденная молекула триптофана не должна ионизироваться.

Однако в реальных условиях потенциал ионизации

триптофана значительно снижается. Это обусловлено тем, что одновременно с процессом ионизации происходит выделение энергии электронной и ориентационной поляризации среды (4 эВ), возникающей в результате взаимодействия диссоциирующих партнеров с молекулами окружения. Следует учитывать также, что потенциал ионизации -электрона азота индольного кольца значительно меньше потенциала ионизации -электронов. Этот потенциал еще больше уменьшается в результате образования водородной связи с участием иминогруппы. Поэтому наиболее вероятно, что электрон отрывается от азота индольного кольца.

Можно представить себе, что фотоионизация осуществляется по следующему механизму. Электрон возбужденной молекулы за время жизни возбужденного состояния успевает вступить во взаимодействие с диполями растворителя, находящимися в наиболее благоприятной конфигурации. В результате этого энергия связи электрона с молекулой оказывается меньшей, чем сумма энергий возбужденного состояния и взаимодействия с растворителем. Отрыв электрона становится энергетически возможным. Следовательно, вероятность отрыва электрона от молекулы зависит не только от энергии возбужденного состояния, но и от полярности и поляризуемости среды, снижающих энергию ионизации, времени жизни возбужденного состояния и вязкости среды, которые определяют вероятность взаимодействия фотоэлектрона с благоприятной диполь-конфигурацией. При этом диполи растворителя как бы притягивают к себе электрон возбужденной молекулы.

Итак, опыты с модельными соединениями при низких температурах убедительно продемонстрировали принципиальную возможность ионизирующего действия ультрафиолетового света на триптофан как по одноквантовому (в условиях, приближающихся к физиологическим), так и по двухквантовому механизму:

Хотя кинетика фотоионизации триптофанилов непосредственно в белке не исследовалась, экспоненциальный

характер их фотодеструкции (как и всего процесса фотоинактивации белков) позволяет прийти к следующему заключению. Если в физиологических условиях белок действительно инактивируется в результате фотоионизации, то эта реакция осуществляется по одноквантовому механизму через синглетные возбужденные состояния.

В дальнейшем, как полагает Ю. А. Владимиров и др., образующийся в белках катион-радикал диссоциирует на протон и нейтральный радикал. Последний, взаимодействуя с соседними группами полипептидной цепи, образует межмолекулярную ковалентную сшивку — стабильный фотопродукт:

Если фотолизу подвергается остаток триптофана, непосредственно входящий в состав активного центра фермента, уже этого достаточно, чтобы белок потерял ферментативную активность.

Если существенный триптофанил находится вне активного центра, то сшивка изменяет баланс водородных, гидрофобных и других слабых сил (множественные разрывы связей), поддерживающих нативную конформацию макромолекулы. В результате инициируется кооперативный процесс денатурации, которая и приводит к потере ферментативной активности. В большинстве случаев непосредственной причиной инактивации являются конформационные изменения макромолекулы. Действительно, фотоинактивации белка сопутствуют конформационные перестройки и оба эти эффекта наблюдаются при одинаковых дозах УФ-света. УФ-индуцированные конформационные перестройки в белках зарегистрированы с помощью методов седиментации, электрофореза, вискозиметрии, полярографии, электронной микроскопии, люминесценции, оптического вращения, осмометрии, кондуктометрии, измерений поверхностного натяжения, растворимости, скорости дейтериевого обмена, устойчивости к протеолитическим ферментам и теплу, количества титруемых кислых, основных и -групп, изучения иммунологических свойств.

В ряде работ отмечается четкая корреляция между степенью инактивации и денатурации белков. Однако не

для всех белков и не при всяких условиях к инактивации ведут генерализованные по всей структуре конформационные перестройки. Иногда бывает достаточно локальных структурных изменений. Так, инактивация уреазы и трипсина не нарушает их комплексирования с антителами, а квантовый выход фотоденатурации трипсина, по данным седиментации, в 2—5 раз ниже квантового выхода фотоинактивации. По данным Аугенштейна, эффективная энтальпия (АН активации ингибирования трипсина УФ-светом сильно зависит от химической природы субстрата, по деструкции которого оценивается остаточная ферментативная активность. Было показано, что для этилового эфира бензоиларгина и казеина АН составляет соответственно 2,5 и 4,7 ккал/моль. Поскольку в опытах Аугенштейна субстрат добавлялся после облучения фермента, то фотофизика и фотохимия инактивации белка во всех случаях были одинаковы, а наблюдавшиеся различия в квантовых выходах инактивации указывали на локальный характер нарушения конформации, которое по-разному сказывалось на центрах сорбции субстратов.

По-видимому, фотоденатурация (локальная или генерализованная) белков может осуществляться и нефотохимическим путем, минуя стадии лабильных и стабильных фотопродуктов при тепловой диссипации энергии электронно-возбужденных состояний триптофанилов (около 100 ккал/моль), ведущей к множественным разрывам водородных и иных связей. Так, было обнаружено, что аргиназа и уреаза, обладающие, как и другие белки, способностью к существованию в двух дискретных функционально активных конформациях в области физиологически умеренных температур (кооперативный переход различаются по квантовым выходам фотоинактивации температурных конформеров Однако скорости фотолиза триптофанилов и цистина, а также природа конечных стабильных фотопродуктов (данные люминесценции) у температурных конформеров оказались одинаковыми. Отсюда следует, что различия в фоточувствительности конформеров могут быть связаны с дополнительной нефотохимической инактивацией макромолекулы.

Скорее всего по этой же причине происходит уменьшение фотоинактивации трипсина после дейтерирования, соответствующее, по данным ИК-спектроскопии, разности энергии и -колебаний. Иными словами, у дейтерированного трипсина облегчен разрыв водородных связей энергией, поглощенной цистином. Сходным образом может быть объяснено уменьшение квантового выхода фотоинактивации трипсина на фоне постоянной скорости фотолиза триптофанилов при изменении вязкости и ионного состава среды, амилазы при образовании фермент-субстратного комплекса, а также гексокиназы при ее комплексировании с регуляторным гормоном инсулином.

Можно думать, наконец, что и отмеченная ранее Мак Лареном сильная зависимость квантовых выходов инактивации белков от pH, ионной силы и состава буфера связана не только с характером их воздействия на фотохимические реакции, но и с изменением вероятности прямой тепловой фотоденатурации.

<< Предыдущий параграф Следующий параграф >>
Оглавление